Oxidativní stres a karcinogeneze - teoretický úvod

Overview

V posledních letech je věnována značná pozornost problematice oxidativního stresu ve vztahu k nádorovým onemocněním.

Volné kyslíkové radikály o jsou molekuly s jedním nebo více volnými elektrony, které se velmi pohotově vážou s nitrobuněčnými strukturami za poškozování jejich funkce. Mezi hlavní volné radikály (VR) patří superoxidový anion, hydroxylový radikál, singletový kyslík, peroxynitrit, peroxid vodíku atd.

Za fyziologických podmínek je v každé buňce stav dynamické rovnováhy, která je udržována odstraňováním nově vznikajících VR a reparací oxidativním stresem poškozených buněčných struktur.

Všeobecný konsenzus přijímá významnou roli oxidativního stresu v karcinogenezi. Předpokládá se, že část nádorových onemocnění vzniká při dlouhodobé oxidativní zátěži v prostředí chronického zánětu. Je prokázaný vztah významných zdrojů VR (kouření, alkohol) v etiologii karcinomů hlavy a krku.

Kauzalita vztahu oxidativního stresu a rakoviny je podmíněná chronickým poškozováním struktury DNA volnými radikály. V případě nadměrného poškozování DNA organismus nestíhá reparovat pozměněnou DNA, která má pak významný mutagenní potenciál.

Autoři v předkládaném sdělení popisují souhrn teoretických poznatků o vzniku, působení oxidativního stresu a ochraně před ním. Dále uvádí přehled hypotéz jeho vztahu ke kancerogenezi.

Klíčová slova:
oxidativní stres, antioxidativní enzymy, nádory hlavy a krku, karcinogeneze, volné kyslíkové radikály.

ÚVOD

V posledních letech je studiu oxidativního stresu u onkologických nemocných věnována značná pozornost. Oxidativní stres můžeme definovat jako stav překonání antioxidativní obrany buňky volnými kyslíkovými radikály (VR). Dochází k němu při zvýšené produkci VR nebo při nedostatečné aktivitě antioxidativní obrany buňky.

VR jsou látky pohotově reagující s buněčnými strukturami díky přítomnosti jednoho nebo více nepárových elektronů. Mezi VR zahrnujeme superoxidový anion, hydroxylový radikál, singletový kyslík, peroxynitrit, peroxid vodíku atd. Produkce VR je endogenní nebo exogenní. Klinicky významné zejména ve vztahu k onkologii hlavy a krku jsou zejména kouření a konzumace alkoholu (19).

Mitochondrie prozánětlivě působících buňek (eozinofily, alveolární makrofágy atd.) jsou významným endogenním zdrojem VR. I za fyziologických podmínek unikají ojedinělé elektrony z dýchacího řetězce, které následně reagují s kyslíkem za tvorby superoxidového anionu. Antioxidativní enzymy 1. stupně (superoxiddismutáza, SOD) jej mění v peroxid vodíku. Vzhledem k oxidativní kapacitě peroxidu vodíku musí být i tento neutralizován antioxidativními enzymy 2. stupně, katalázou v peroxizomech (CAT) a glutathionperoxidázou v cytoplazmě a v mitochondriích (GPx) (obr. 1). Nejsou-li VR neutralizovány dostatečně rychle antioxidativními enzymy nebo neenzymatickými antioxidanty, dochází k poškození biomolekul a buněčných struktur (27). Mezi poškozované buněčné struktury patří membrány, kde vlivem VR dochází k poškozování membránových fosfolipidů, kdy jedním z produktů je i malondialdehyd (MDA). Jeho hladina vypovídá o míře expozice buňky oxidativnímu stresu. Působením VR též dochází k modifikaci struktury proteinů a zlomům DNA (21). Oxidativním stresem modifikovaná DNA je geneticky nestabilní, čímž má větší tendenci k mutagenezi.

Řada autorů v posledních letech popsala několik úrovní vztahu oxidativní zátěže k riziku vzniku a prognóze rakoviny obecně. Jednak VR oxidativně poškozují DNA, jejichž mutace jsou dávány do souvislosti s karcinogenezí. Dále většina maligních buněk postrádá fyziologickou schopnost vypořádat se s oxidativním stresem kvůli změněné aktivitě AOE (4).

Předpokládá se úzký vztah mezi spinocelulárními karcinomy hlavy a krku a oxidativním stresem, protože alkohol a kouření jako zdroje masivní oxidativní zátěže jsou jasně přijímány jako etiologické faktory těchto malignit (4).

Vzhledem k působení chemoterapie i ozáření na maligní buňky VR a díky alteraci mechanismů neutralizujících oxidativní zátěž u těchto buněk, lze predikovat i vztah oxidativního stresu k rezistenci u adjuvantní terapie. Zdá se, že chemo- i radiorezistence může být podmíněna neschopností buňky vypořádat se s oxidativním stresem.

V onkologii hlavy a krku zatím nebyly žádné významné onkomarkery zavedeny do rutinní praxe. Dle nejnovějších poznatků se právě markery oxidativního stresu teoreticky nabízejí jako vhodné ukazatele.

Zdroje volných radikálů

VR podle původu můžeme rozdělit na endogenní, které jsou produkované v organismu, a exogenní, které se do organismu dostávají ze zevního prostředí.

Mitochondrie je organela zodpovědná za aerobní dýchání a je hlavním místem tvorby endogenních VR. Za fyziologických podmínek unikají četné elektrony (e^-) z dýchacího řetězce. Podle Curtina množství e^- reagujících s jinými molekulami za tvorby VR představuje až 1-2 % všech e^- přenášených v dýchacím řetězci (7). Další zdroje endogenního VR jsou enzymatické reakce katalyzované oxidázami (zejména xanthinoxidázou) nebo kaskáda arachidonové kyseliny (28).

Důležitou součástí zánětlivé odpovědi je využití VR produkovaných v polymorfonukleárech a makrofágách proti mikrobiálním patogenům. Primárním zdrojem endogenních VR při rozpoznání mikroorganismů je NADPH ve fagocytech. Tento proces se nazývá „oxidative burst“. V případě, že se přísně regulovaná tvorba VR vymkne kontrole, poškozují nejen patogeny samotné, ale i tkáně organismu vlastní. Příkladem může být ARDS, kdy pneumocyty vystavené bakteriálním toxinům či aktivované komplementem chemotakticky, přivolávají aktivované neutrofily, kterými produkované VR vedou k poškození kapilárních membrán buněk a následně ke zvýšení permeability buněčných membrán. Je obecně známo, že eozinofily hrají důležitou roli u astmatu. Eozinofilní peroxidáza, která je obsažena v jejich specifických granulech, uvolňuje VR po aktivaci specifickými stimuly (3. Agosti v souladu s Ayarsem potvrzují významný potenciál peroxidázy produkované v eozinofilech poškozovat buňky respiračního epitelu – pneumocyty 2. typu (1) a buňky nosního epitelu (2).

Dále nutno zmínit VR, které se dostávají do organismu ze zevního prostředí. V mnoha moderních městech se hladiny oxidačních látek v atmosféře díky industrializaci výrazně zvýšily. Nejvýznamnějšími oxidanty zevního prostředí jsou ozon a cigaretový kouř. Vykouření jedné cigarety představuje zatížení organismu až 10¹⁷ volných radikálů (6, 21). Inhalované exogenní VR se dostávají do kontaktu s velkou plochou respiračního epitelu, čímž se plíce stávají oxidativním stresem nejvíce ohroženým orgánem. Exogenní VR jsou tvořeny taky vlivem alkoholu, ionizujícího záření, ultrafialového světla (např. v slunečném záření) či xenobiotik.

Poškozování makromolekul oxidativním stresem

Na buněčné úrovni VR poškozují celou řadu buněčných struktur jako fosfolipidy buněčných membrán, nukleové kyseliny a bílkoviny. Nejzávažnější a nejlépe prostudována je lipidová peroxidace, při které vlivem VR dochází k neenzymové peroxidaci polynenasycených mastných kyselin membránových fosfolipidů (obr. 2). Jediná molekula VR vyvolá vznik velkého množství molekul hydroperoxidů v buněčné membráně, čímž se zvyšuje její permeabilita. Tento stav vede k poruše základních buněčných funkcí či dokonce ke smrti buňky (3). Jedním z produktů lipidové peroxidace je i malondialdehyd (MDA), který se stanovuje jako marker míry oxidativního poškození buňky.

Oxidační modifikace proteinů probíhá podobně jako u lipidů. Vznikající hydroperoxidy se vážou na kov v aktivním centru enzymů, např. na železo u katalázy, čímž jej deaktivují. Na molekulární úrovni VR modulují zánětlivý proces stimulací uvolňování histaminu žírnými buňkami a aktivací kaskády arachidonové kyseliny. Na tkáňové úrovni VR zvyšují kontraktilitu hladkých svalů dýchacích cest, vyvolávají down regulaci ß-adrenergních receptorů, zvyšují permeabilitu endotelu cév, způsobují produkci viskózního sekretu, bronchiální hyperreaktivitu a dysfunkci ciliárního transportu (28).

Antioxidativní ochranný systém

Vzestup koncentrace kyslíku v zemské atmosféře před 2,5 miliardami let fotosyntetickou aktivitou sinic musel způsobit stres, který mohly přežít jen druhy, u nichž se vyvinuly mechanismy chránící před kyslíkem a jeho metabolity (20). Organismus se brání tvorbě nadměrného množství VR opravou a novotvorbou kyslíkem poškozovaných struktur, regulací exprese a aktivity enzymů tvořících VR nebo eliminací již vytvořených endogenních či exogenních VR v organismu, tzv. scavengery. Např. první linie obrany vychytává exogenní VR ještě v tracheobronchiálním sekretu, tedy dříve než mohou proniknout intracelulárně a způsobit poškození buněčných struktur.

Antioxidativní enzymy

CuZnSOD nebo SOD1 - Měďnato-zinečnatá superoxiddismutáza se nachází v cytoplazmě prakticky všech buněk vyšších živočichů, zejména v erytrocytech, hepatocytech a neuronech. Gen pro CuZnSOD je lokalizovaný na chromozomu 21. Jeho mutace je popisována u jedinců s familiární amyotrofickou laterální sklerózou (30).

MnSOD nebo SOD2 – Superoxiddismutáza obsahující mangan, je popisována v mitochondriích, tedy v buněčné organele, kde se tvoří většina VR. U savců jsou nejvyšší hladiny v buňkách srdce, mozku, ledvin a játrech. Její gen je lokalizovaný na 6. chromozomu. Zatím je jen málo známých mutací MnSOD. Nejvíce pozornosti je věnováno záměnám nukleotidů na pozicích 47 a -9 podmiňujících změny v pořadí aminokyselin (Ala/Tre a Ala/Val) a způsobujících změnu aktivity exprimovaného proteinu (25). Podobnou změnu fenotypu způsobuje změna nukleotidů na pozici 245 (Ile/Tre). Varianta  s isoleucinem má až 3x vyšší enzymovou aktivitu (32).

EC-SOD nebo SOD3 – Extracelulární forma superoxiddismutázy, obsahující rovněž měď a zinek, byla prokázána v plazmě a lymfě. Váže se na heparan sulfát a proteoglykany endotelu cév (30). Sandstrom zjistil až 10x vyšší hladinu EC-SOD v plazmě u 2 % švédské populace vyvolanou záměnou  aminokyseliny Arg za Gly na pozici 213 (25). Tato změna pravděpodobně snižuje afinitu EC-SOD ke strukturám endotelových buněk. Incidence EC-SOD napovídá, že se s velkou pravděpodobností jedná o genetickou predispozici k vyšší hladině zmíněného enzymu.

GPx1 – Selen, obsahující glutathionperoxidáza kódována na 3. chromozomu, je exprimován u lidí zejména v cytoplazmě erytrocytů, buněk ledvin a jater. Několik známých mutací nemá vliv na aktivitu enzymu. Ratnasinghe prokázal asociaci mezi jednou variantou polymorfismu GPx1 na  pozici 198 s rakovinou plic. Rovněž myši neschopné exprimovat GPx1 mají normální fenotyp, ale jsou citlivější na zvýšení oxidativního stresu vyvolaného paraquatem nebo H₂O₂. (22)

GPx2 – Cytoplazmatická glutathionperoxidáza, obsahující selen, je primárně tvořena v gastrointestinálním traktu savců, kde chrání před toxicitou pozřených lipidových peroxidů. Její gen se nachází se na 14. chromozomu.

GPx3 – Extracelulární glutathionperoxidáza se tvoří zejména v plazmě a její gen je lokalizován na 5. chromozomu. Jejím hlavním úkolem je redukovat hydroperoxidy komplexních lipidů, např. fosfatidylcholinu, v extracelulárních tekutinách.

CAT – Molekula katalázy, obsahující porfyrinový kruh se železem, je tvořena v peroxizomech erytrocytů. CAT je jedním z nejefektivnějších známých enzymů. Gen pro ní byl prokázán na 11. chromozomu. Hunt zjistil její up-regulaci při zvýšeném oxidativním stresu (14).

Glutathionový redoxní cyklus tvořený glutathionem (GSH), GPx a glutathionreduktázou (GR) je pravděpodobně nejdůležitější buněčný antioxidativní systém. Podílí se nejen na vychytávání VR, ale i na regulaci intracelulární redoxní rovnováhy. GPx redukuje H₂O₂ za současné oxidace GSH na jeho oxidovanou formu s disulfidovým můstkem (GSSG). GSSG je poté zpátky regenerován GR na GSH a opět připravený k vychytávání H₂O₂. Schopnost buňky tvořit GSH, ať novou syntézou nebo redukcí GSSG, je důležitým faktorem efektivnosti antioxidativní obrany.

Genetický podklad antioxidativních obranných mechanismů

Kapacita antioxidativních systémů buňky je závislá na genetické predispozici každého jedince. AOE u zdravého jedince musí zvládat neutralizaci jak fyziologicky tvořeného množství VR, tak i zvýšenou oxidativní zátěž, např. při zánětu. Právě geneticky podmíněná schopnost adaptovat efektivitu antioxidativní obrany na zvýšenou oxidativní zátěž je pravděpodobně zodpovědná za interindividuální variabilitu a rozdílnou klinickou manifestaci oxidativního stresu.

V současnosti jsou známé lokusy většiny významných AOE. Genetická variabilita u lidí je z  větší části podmíněna variantami nukleotidů na určité pozici řetězce DNA, tzv. polymorfismy jediného nukleotidu (single nucleotide polymorphism, SNP). Většina SNP je němá bez jakéhokoliv vlivu na funkci proteinů. Naopak některé SNP výrazně podmiňují fenotyp (9).

Četné výzkumy se věnují sledování fenotypu různých polymorfismů AOE. Forsbergová uvádí, že polymorfismus u CAT signifikantně ovlivňuje její hladinu v buňkách, a tím i schopnost buňky bránit se oxidativnímu stresu (10). Fu uzavírá, že delece genů pro GPx1 u myší nevyvolá žádnou změnu fenotypu při běžné oxidativní zátěži, ale hepatocyty těchto myší se stanou senzitivnější k elevovanému oxidativnímu stresu (11).

Předpoklad geneticky podmíněné schopnosti onkologického pacienta posílit antioxidativní obranu v situaci zvýšené tvorby VR nádorovou tkání byl publikován Genkingerem. Pozoroval nižší riziko vzniku rakoviny obecně u heterozygotů Ala/Val (12) v souboru 6151 dárců krve.

Oxidativní stres a nádory hlavy a krku

Řada autorů v posledních letech popsala několik úrovní vztahu oxidativní zátěže k riziku vzniku a prognóze rakoviny obecně. Předpokládá se, že část nádorových onemocnění vzniká při dlouhodobé oxidativní zátěži v prostředí chronického zánětu (collitis ulcerosa-kolorektální karcinom, virová hepatitis-hepatocelulární karcinom atd.) (8). Dále je prokázaná role významných exogenních zdrojů VR (kouření, alkohol) v etiologii rakoviny. Předpokládá se zvláště úzký vztah mezi spinocelulárními karcinomy hlavy a krku a oxidativním stresem, protože alkohol a kouření jako zdroje masivní oxidativní zátěže jsou jasně přijímány jako etiologické faktory těchto malignit (4). Ke karcinogenezi přispívá i akumulace mutagenního potenciálu v případě, že organismus nestíhá reparovat oxidativním stresem poškozenou DNA. Oxidativní zátěž se ještě posílí u již vytvořené malignity, protože většina maligních buněk postrádá fyziologickou schopnost vypořádat se s oxidativním stresem kvůli změněné aktivitě AOE (4). Dále někteří autoři popisují i samotnou nádorovou tkáň jako zdroj rostoucího množství VR (5, 13, 29). Zatím není úplně objasněno, který zdroj oxidativní zátěže hraje nejdůležitější roli. Domníváme se, že in vivo se jedná spíše o kombinaci výše popsaných zdrojů VR, kdy jednotlivé zdroje mohou v různých fázích karcinogeneze hrát více nebo méně dominantní roli.

Několika autory popsaná intenzivnější lipidová peroxidace  a nižší aktivita AOE u pacientů s karcinomy hlavy a krku (17, 18, 23, 26, 31) odpovídá zvýšenému oxidativnímu stresu u onkologických nemocných. Může se jednat o vyšší riziko vzniku rakoviny u pacientů s dlouhodobou expozicí vysokým hladinám VR nebo naopak vyšší oxidativní zátěž může vznikat v důsledku obrovského množství VR uvolňovaného samotnou nádorovou tkáňí. Po chirurgické resekci nádoru dochází k poklesu lipidové peroxidace a zvýšení aktivity AOE (5, 29). Hrizostov dokonce 10-20 dní po resekci tumoru zjistil normalizaci hodnot MDA jako ukazatele oxidativní zátěže v plazmě (13). Naopak Samir popsal elevaci produktů lipoperoxidace 3 týdny po laryngektomii (24). Szuster-Ciesielská zjistila zvýšenou hladinu VR korelující se stadiem u laryngeálního karcinomu (29). Podobně Yigitbasi popsal  nepřímou úměru mezi aktivitou SOD a stupněm diferenciace (33). Je zajímavé, že Bohn nezjistil rozdílnou hladinu oxidativního stresu měřenou ihned po ukončení kurativního ozáření a 6 týdnů poté (4). Plazmatická hladina MDA, jako produktu lipoperoxidace korelující s expozicí buňky oxidativnímu stresu, je zvýšená u recidivující nemoci (16, 23).

V souladu s dostupnými literárními zdroji věříme, že nádorová tkáň je významným zdrojem VR. Narůstající množství nádorové tkáně (vyšší stadium nebo recidiva) koreluje s větším oxidativním stresem. Během destrukce nádorové tkáně radioterapií by mělo docházet k poklesu VR podobně jako po chirurgické resekci tumoru (13). Naopak samotná radioterapie je zdrojem masivní oxidativní zátěže. Z předchozího vyvozujeme, že snížení produkce VR nádorovými buňkami během ozařování je pravděpodobně substituováno oxidativním stresem vyvolaným radioterapií.

Vzhledem k působení chemoterapie i ozáření na maligní buňky volnými radikály a díky alteraci mechanismů neutralizujících oxidativní zátěž u těchto buněk, lze predikovat i vztah oxidativního stresu k rezistenci u adjuvantní terapie. Zdá se, že chemo- i radiorezistence může být podmíněna schopností buňky vypořádat se s oxidativním stresem. Navíc toxicita chemo/radioterapie je nejspíš ovlivněna neschopností zdravých buněk vypořádat se s masivními dávkami VR během celkově podávané adjuvantní terapie.

V onkologii hlavy a krku zatím nebyly žádné sérové nádorové markery s dostatečnou senzitivitou a specificitou zavedeny do rutinní praxe. Dle nejnovějších poznatků právě markery oxidativního stresu teoreticky nabízejí velký potenciál.

V dostupné literatuře se nám nepodařilo dohledat teoretický podklad funkce VR při metastazování. Využití VR maligními buňkami se nabízí hned v několika fázích procesu metastatické diseminace (intravazace, záchyt ve vzdálené tkáni, extravazace). Nejen v této oblasti je nutný další důkladný výzkum.

Potenciální využití studia oxidativního stresu v onkologii nádorů hlavy a krku

Výsledky výzkumů z posledních let nás opravňují předpokládat, že významný podíl na vzniku, progresi a následné prognóze nádorů hlavy a krku hrají exogenní zdroje volných kyslíkových radikálů jako kouření a konzumace alkoholu. Podaří-li se prokázat geneticky podmíněnou schopnost jedince vypořádat se s nadměrným oxidativním stresem, bude možné postavit hypotézu, že nositelé určité genetické varianty daného polymorfismu budou náchylnější ke vzniku onkologického onemocnění, popřípadě k jeho agresivnějšímu průběhu.

Již naše pilotní výsledky naznačují, že dle některých parametrů oxidativního stresu je možné předvídat větší lokoregionální diseminaci nebo časnější recidivu. Pokud se nám podaří potvrdit např. zvýšení určitého parametru oxidativního stresu u pacientů s výrazným metastatickým potenciálem do krčních uzlin, tak u této skupiny nemocných bude provedena elektivní bloková disekce. Naopak skupina nemocných s nízkou hladinou zmíněného parametru bude ušetřena zákroku na lymfatickém systému na krku, který je spojen se známými riziky a komplikacemi. Podobně při průkazu korelace mezi např. vysokou hladinou určitého parametru oxidativního stresu a délkou remise, bude možné vysokou hladinu zmíněného parametru označit jako rizikový faktor časné recidivy a přiklonit se k radikálnější adjuvantní terapii. Na základě dnes dostupných teoretických poznatků lze předpokládat, že mezi parametry oxidativního stresu mohou být nalezeny prognostické onkologické markery se všemi významnými důsledky pro klinickou praxi. 

ZÁVĚR

Výsledky recentních výzkumů nás opravňují předpokládat, že významný podíl na vzniku, progresi a následné prognóze nádorů hlavy a krku hraje oxidativní stres. Proto lze předpokládat, že mezi parametry oxidativního stresu budou nalezeny prognostické onkologické markery se všemi významnými důsledky pro klinickou praxi. Vhodnými jsou zejména parametry vystavení buňky oxidativnímu stresu (MDA). Dále aktivita některých AOE by mohla predikovat senzitivitu nádorových buněk a míru toxicity ve zdravých buňkách během radio- nebo chemoterapie. Výzkum oxidativního stresu v onkologii hlavy a krku je jen na začátku. Dnes máme k dispozici dostatečný teoretický základ k hledání klinických vztahů mezi onkologickou charakteristikou pacientů a parametry oxidativního stresu.

Poděkování:

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR č. 10/II NR/7996-3. 

Došlo 6. 10. 2006 

MUDr. Richard Salzman

Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku

LF MU a FN u sv. Anny

Pekařská 53

625 00  Brno