Přítomnost Helicobacter pylori v orofaryngu a její vztah k žaludeční infekci

Souhrn

Helicobacter pylori (HP) je významný lidský patogen, který je spojován s chronickou gastritidou, žaludečním vředem a s nádory žaludku, především s adenokarcinomem a MALT lymfomem. V posledních letech byl HP nalezen v ústní dutině, především ve slinách a dentálním plaku. Do této doby byl za jediný rezervoár infekce HP v lidském organismu považován žaludek. Cílem práce bylo zjištění, zda může být HP v orofaryngu přítomen nezávisle na žaludeční infekci. Do studie bylo zařazeno 20 osob s prokázanou přítomností HP v orofaryngu. U těchto osob byla zjišťována žaludeční infekce ureázovým dechovým testem (UBT). Přítomnost HP v žaludku byla prokázána pouze u 8 jedinců. Zbylých 12 pacientů bylo UBT negativních. Z těchto výsledků vyplývá, že HP může být přítomen v orofaryngeální oblasti nezávisle na žaludeční infekci.

Klíčová slova:
Helicobacter pylori (HP), ureázový dechový test (UBT), orofaryng, PCR, žaludek.

ÚVOD

Infekce HP je rozšířena po celém světě. Ve státech střední a východní Evropy je promořenost udávána od 60 do 95 % (4). V rozvojových zemích je vysoké procento infekce spojeno s nízkým so-cioekonomickým statutem a infekce se zpravidla rozvíjí od časného dětství. Naopak ve vyspělých zemích je prevalence nízká. Klinické projevy se objevují pouze u 10-15 % nakažených jedinců, což je dáno různou imunitní odpovědí hostitele a odlišným stupněm virulence kmenů (24).

Nejvýznamnějšími faktory virulence jsou vakuolizační cytotoxin (vac A) a cytotoxin asociovaný gen (CagA), dále adheziny, lipopolysacharid a ureáza (20). VacA je cytotoxin, který indukuje vakuolizaci epiteliálních buněk. Je kódován genem vac A, který nesou všechny kmeny HP. Pouze asi 50 % kmenů produkuje vac A protein (22). Kmeny produkující toxin jsou spojovány s vyšším výskytem peptických vředů a rakoviny žaludku. Mezi jednotlivými kmeny existují ve struktuře vacA genu rozdíly. Za velmi toxické jsou považovány kmeny s alelami s1 m1 a jsou spojovány s mnoha formami gastritidy, atrofie a intestinální metaplázie [10]. Přítomnost vacA také indukuje expresi VEGF (vascular endothelial growth factor) a vede ke spuštění nádorového procesu (20).

CagA gen, čili cytotoxin - asociovaný gen A - kóduje vysokomolekulární a vysoce imunoreaktivní protein, který je přítomný asi u 60 % kmenů HP (20). Tento gen je součástí ostrůvku patogenicity cag - PAI, který zahrnuje 31 genů , které hrají roli v aktivaci chemokinů a MAP - kinázy v cestě aktivace prozánětlivých faktorů (20). V hostitelské buňce je cag A fosforylován kinázami ze skupiny Src, což vede k produkci různých cytokinů a růstových faktorů (22). Kmeny s přítomností cagA jsou označovány jako CagA+. Pacienti infikovaní těmito kmeny mají vyšší zánětlivou odpověď a je u nich zaznamenán vyšší výskyt peptických vředů, atrofické gastritidy, rakoviny žaludku (15). Protein cagA a další virulentní faktory jsou do hostitelské buňky injektovány prostřednictvím sekrečního systému typu IV (10).

Přežití HP je možné díky schopnosti produkovat ureázu, což je enzym, který štěpí v žaludku ureu na amoniak a oxid uhličitý. Zajišťuje neutralizaci kyselého prostředí ve svém okolí. Ureáza hraje důležitou roli ve vyhodnocení ureázového dechového testu. Při stanovení pozitivity/negativity UBT se laboratorně vyhodnocuje koncentrace oxidu značeného uhličitého ve vydechovaném vzduchu.

Infekce HP aktivuje neutrofily, které tvoří volné radikály (ROS), zejména superoxid a hydrogen peroxidový ion. Proti těmto radikálům existují v buňkách žaludeční sliznice enzymy, které ROS ničí. Vysoká aktivita těchto enzymů byla zaznamenána u Cag A+ kmenů HP (20).

Po proniknutí HP do žaludku se uplatňuje imunita přirozená a imunita získaná. Přirozenou imunitu zastupují antigen prezentující buňky, a to zvláště buňky dendritické a monocyty. Tyto buňky mají na svém povrchu TLRs (Toll - like receptors). Po kontaktu s bakterií dochází k sekreci prozánětlivých cytokinů – TNF-α, IL - 1β a IL - 8 (22). IL - 8 má vliv na buněčnou proliferaci, migraci a tumorovou angiogenezi. Dominantní odpovědí je Th - 1 imunitní odpověď v žaludeční sliznici, charakterizovaná indukcí IFN - γ. Th - 1 odpověď je spojená se zvýšeným vyplavováním prozánětlivých cytokinů – IL - 12, IL - 18 a TNF - α a vede k produkci IgG (22).

METODY PRŮKAZU HP

Metody průkazu HP jsou invazivní a neinvazivní. Pro žaludek se jako standardní test používá ureázový dechový test – Urea Breath Test (UBT).

UBT je v současné době považován za zlatý standard metod k detekci Helicobacter pylori v žaludku (14). První vztah UBT (¹⁴C) k detekci žaludeční ureázové aktivity u kočky byl publikován v roce 1954 Kornbergem. V roce 1987 byl použit Grahamem neradioaktivní izotop uhlíku ¹³ C, což je prvek v prostředí přirozeně přítomný. Vzorky jsou analyzovány metodou hmotnostní spektrometrie, nebo metodou NDIRS (nondispersive infrared spectrometry). Tato metoda je založená na změnách oscilačního spektra molekul izotopů CO₂ v infračerveném světle. Použití této metody spočívá měření absolutních koncentrací plynu a naměřené hodnoty více kolísají. Důležité je kritérium změny poměru vydechovaného CO₂ v čase 30 oproti T - DOB větší než 5 š (14). Dechový test byl použit i v modifikovaném provedení jako endoskopický UBT, vykazující přesnost v detekci. UBT patří do popředí všech diagnostických metod HP. Podle Maastrichtského konsenzu 2 z roku 2000 se jedná o vyšetření vhodné k průkazu infekce a rovněž je pokládáno za vyšetření určené ke kontrole eradikace. Ke zhodnocení UBT byla publikována řada prací, jejichž autoři v naprosté většině považují uvedenou metodu za jednu z nejdůležitějších pro detekci HP. Největším problémem dechových testů zůstává kvantitativní interpretace. Objem vzduchu při dýchání se liší v závislosti na fyzické aktivitě, psychickém stresu a dalších faktorech. Výsledkem je jejich vysoká biologická variabilita.

VÝSKYT HP V ÚSTNÍ DUTINĚ A HLTANU

Výskyt HP v ústní dutině a hltanu je intenzivně studován. Byla prokázána jeho přítomnost v lidském dentálním plaku a ve slinách (8, 12). Důležitost tonzilární tkáně pro kolonizaci HP jako první zdůraznil Minocha (19). HP byl prokázán pomocí CLO testu v adenoidní tkáni (25). Vzorek adenoidní tkáně i patrových tonzil byl pozitivní také při použití RUT a histologie (1). Cirak a spol. (6) a Bulut a spol. (3) detekovali pomocí metody PCR Cag A⁺ kmeny. Bitar a spol. (2) sledovali výskyt HP v středoušním sekretu a v adenoidní vegetaci pomocí kultivace, RUT a PCR. Pozitivita HP byla zjištěna pouze ve vzorku adenoidní vegetace metodou RUT. HP byl zjištěn také ve středoušním sekretu a adenoidních vegetacích pomocí PCR s použitím primeru pro 23 S  ribosomální RNA (26).Yilmaz a spol. (27)našli HP také v aspirátech středoušního sekretu pomocí kultivace a PCR. Byl také srovnáván výskyt HP na povrchu a uvnitř tonzil. Z celkem 106 vzorků bylo pozitivních 56 povrchových (53 %) a 24 vzorků ze stromatu tonzil (23 %) (13). Předpokládá se také souvislost infekce HP a orofaryngeálních nádorů. Tento vztah zkoumala řada autorů. Pouze jedna studie je však založená na genotypizaci kmenů HP pomocí metody real-time PCR (21).

Cílem práce je zjištění incidence probíhající žaludeční infekce HP pomocí ureázového dechového testu u pacientů, u kterých byla zjištěna přítomnost HP v tonzilární tkáni metodou real-time PCR.

METODY

Do studie bylo zařazeno celkem 40 pacientů s diagnózou karcinomu tonzil, syndromem spánkové apnoe a chronickou tonzilitidou. Tito pacienti podstoupili v letech 2006–2008 chirurgický výkon na klinice ORL a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FN v Motole. Během operace jim byl odebrán vzorek orofaryngeální tkáně. Z uvedených vzorků byla u 20 pacientů zjištěna pomocí metody real–time PCR pozitivita Helicobacter pylori v orofaryngu (tab. 1). U těchto pacientů byl proveden UBT v době od ledna do srpna 2008. U žádného z pacientů nebyla před provedením UBT provedena eradikace HP. U osob UBT pozitivních byla následně provedena gastroskopie k ověření probíhající žaludeční infekce pomocí PCR ze vzorků žaludeční sliznice.

Ureázový dechový test – Urea – Breath - Test (UBT)

Test byl prováděn ráno nalačno. Pacienti provedli výdech do prvního sáčku, poté vypili 200 ml 100% pomerančové šťávy se 100 mg ¹³C močoviny. Po 30 minutách byl odebrán vzorek dechu do druhého sáčku. Sáčky byly odeslány do laboratoře a zpracovány do 1 týdne od odběru.

Real–time–PCR

Real–time PCR je vysoce senzitivní variantou PCR metody. Umožňuje provádět genotypizaci jednotlivých kmenů HP přímo z tkáňových vzorků. Vyšetření byla prováděna na přístroji Light-Cycler^R 2.0 s využitím specifických primerů a sond pro cagA gen a pro signální a střední sekvenci vacA genu.

VÝSLEDKY

Z dvaceti pacientů s PCR prokázanou orofaryngeální přítomností infekce HP bylo celkem 8 (40 %) UBT pozitivních. U všech těchto osob byla následně ověřena přítomnost žaludeční infekce pomocí PCR. U zbylých 12 osob (60 %) byl ureázový dechový test negativní (tab. 2, graf 1).

DISKUSE

Dosud publikované práce, jejichž cílem byla detekce HP v ústní dutině, byly většinou zaměřeny na pacienty se žaludečními obtížemi, případně s  již prokázanou žaludeční infekcí HP. Pacienti zařazeni do této studie byli vybráni na základě pozitivního nálezu HP v  orofaryngu a následně u nich byla zjišťována přítomnost HP v  žaludku pomocí UBT. Ve shodě s  prací Burgerse (5) bylo prokázáno, že se HP může nacházet v ústní dutině, aniž by byl přítomen zároveň v  žaludku.

UBT je v  současné době považován za zcela spolehlivou neinvazivní metodu detekce žaludeční HP infekce (7). Základní metodika UBT je uzpůsobena tak, že vylučuje detekci HP v  jiné lokalizaci než v  žaludku. Jedna studie byla zaměřena na aplikaci UBT v ústní dutině (16), kdy autoři nechali pacienty vyplachovat ústa roztokem značené urey.

U pacientů v  této studii byla UBT pozitivita potvrzena endoskopií a detekcí HP v  bioptickém materiálu. V  minulosti byla diskutována otázka, zda přítomnost HP v  orofaryngu není jen přechodná, např. způsobená gastroezofageálním refluxem. Výsledky této studie ukazují, že kolonizace orofaryngu je nezávislá na žaludeční infekci HP (tab. 3).

Metody detekce HP jsou invazivní a neinvazivní. Pro oblast orofaryngu jsou vhodné metody invazivní. Detekce HP v této oblasti je však značně limitována. Při použití histologie se setkáváme s problémem, který je představován výskytem jiných bakteriálních kmenů. Tato metoda je tedy málo specifická [9].

S falešně pozitivními výsledky se můžeme setkat při aplikaci CLO testu nebo RUT. Tyto metody jsou založeny na průkazu HP na základě barevné reakce, která vzniká po reakci substrátu s ureou. Hlavním důvodem možných falešně pozitivních výsledků je existence dalších ureázu-produktujících kmenů v této oblasti (9).

Kultivace je považována za zlatý standard pro detekci HP v žaludku. V ústní dutině je však její použití značně limitováno (9). Je náročná na přesnost provedení. Klinická významnost spočívá ve stanovení citlivosti vypěstovaného kmene na antibiotika, zejména v případech neúspěšné eradikace. Vzorky se vyhodnocují po týdenní inkubaci (18). Nevýhodou použití kultivace v orofaryngu je možná inhibice HP jinými orálními druhy baktérií (11).

Využití molekulárních metod (PCR) umožňuje amplifikaci HP – specifického regionu DNA (23). Využívá se standardní (end-point) PCR pro detekci zejména cagA a vacA genů (18). Tato metoda je vysoce specifická a senzitivní. Při jejím použití v orofaryngu však byly výsledky studií vysoce variabilní, mezi 0 % - 90 % (9).

Genotypizace pomocí PCR metody umožňuje rozlišovat různé kmeny HP a jejich geny kódující různé faktory virulence (21). V posledních letech je využívána také real–time PCR. Představuje zlom v diagnostice HP, protože umožňuje provádět genotypizaci jednotlivých kmenů HP přímo ze tkáňových vzorků. Při použití PCR detekce však nelze získat přesnou představu, zda se jedná o viabilní či mrtvé bakterie (9). PCR je v současné době považována za nejvíce senzitivní metodu k detekci HP v orofaryngu. Je rezistentní vůči externím faktorům a je zatížena nejmenším rizikem falešně pozitivních či falešně negativních výsledků (17).

ZÁVĚR

Na základě výsledků studie můžeme konstatovat, že infekce Helicobacter pylori může existovat samostatně v orofaryngu bez současné koexistence infekce žaludeční. Toto tvrzení dokazuje skutečnost, že většina pacientů, u nichž byla zjištěna PCR pozitivita v orofaryngu, byla UBT negativní.

MUDr. Eva Nártová

Klinika ORL a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FNM

V Úvalu 84

150 06 Praha 5-Motol